Метод ана-телофазного анализа хромосомных аберраций

В процессе работы по созданию детального описания методики Allium test потребовалось так же и более детальное описание метода ана-телофазного анализа – основного генетического теста применяющегося в методике Allium test. В целом информации по ана-телофазному анализу обнаружилось не много, так как он, как правило, идет в тесном сплаве с Allium test. Тем не менее данный анализ заслуживает более подробного описания. Начнем по порядку:

Определение

Ана-телофазный анализ – генетический тест, основанный на визуальном учете хромосомных аберрации (повреждения хромосом) на стадии анафазы и телофазы митотического цикла клетки. Ана-телофазный анализ простой, экономичный, не требует знания кариотипа и идентификации хромосом. Он позволяет выявить лишь определенные типы хромосомных аберраций, но его чувствительность вполне достаточна для заключения «мутагенен» или «не мутагенен» фактор. Ана-телофазный анализ является достаточно чувствительным, корректным и удобным на первом этапе экотоксикогенетического исследования.

История

Выбросы генотоксикантов в окружающую среду в результате антропогенной активности людей порождают необходимость в подходящих генетических тестах, чтобы оценить потенциальное воздействие данных факторов на экосистемы. Ана-телофазный анализ был описан как экспрессный и экономичный генетический тест. Среди наиболее ранних исследований, в которых данный анализ был применен, следует отметить эксперименты на луке (A. Levan). До настоящего времени применяется как основной метод генетического анализа для растительной тест-системы Allium test, в которой исследуется влияние различных генотоксикантов на клетки корневых меристем.

Чувствительность и применимость

Ана-телофазный анализ высокочувствителен при тестах самой разной направленности. Будь то пробы субстратов из окружающей среды (вода, почва, донные отложения) или же вещества антропогенного происхождения, а так же излучения различного спектра (как ионизирующие, так и неионизирующие). Кроме того достоинством данного анализа является его универсальность (он применим практически во всех случаях, когда есть митозы) и простота в приготовлении препаратов, что очень важно при работе с клетками животных. Ана-телофазный анализ хромосомных аберраций на клетках лука (Allium cepa), рекомендован как инструмент цитомониторинга окружающей среды. Путем измерения генотоксичности, он способствует оценке степени экологического риска от средств бытового и промышленного назначения, постоянно внедряемых и становящихся все более важными в повседневной жизни.

Техника проведения анализа

Включает анализ под микроскопом препарата клеток, зафиксированных и окрашенных на стадии пролиферации. Существует ряд вариаций ана-телофазного анализа. Так, согласно оригинальному варианту анализа, описанному Fiskesjo (1985 г.) на препарате подсчитываются первые 100 анафазных и телофазных клеток, из которых отмечаются аберрантные. Позднее стал применяться иной вариант (И.М. Прохорова, 2003), который учитывает все анафазы и телофазы на препарате, среди которых отмечаются аберрантные. Пригодными для учета хромосомных аберраций являются не очень ранние анафазы и ранние телофазы.Поскольку делящаяся клетка не всегда распластывается на препарате по продольной оси деления, то при отборе клеток, пригодных для подсчета хромосомных аберраций, надо принимать во внимание расстояние между дочерними ядрами - оно должно быть не меньше размера одного из них.

Типы анализируемых аберраций

На стадии анафазы и телофазы подсчитываются две классические для данного анализа категории аберраций, представляющие собой отставший от полюсов хромосомный материал (ацентрические фрагменты и кольца, отставшие хромосомы) и мосты. Все они достаточно хорошо видны визуально и различимы. Очень часто в отдельную категорию включаются и подсчитываются отставания и забегания, указывающие на изменения ахроматинового веретена деления.

1. Ацентрические фрагменты и кольца могут быть одиночными и парными. Они располагаются между дочерними звездами или в стороне от них.Основная задача сводится к распознаванию одиночности или парности и к отличию их от отставших хромосом. Одиночные фрагменты представляют собой фрагменты хроматидного происхождения. Потеря одного  фрагмента из пары (хромосомного происхождения) - явление, очевидно, редкое, поскольку притяжение между сестринскими хроматидами сохраняется и на стадии анафазы. По этой же причине маловероятно предположение, что одиночный фрагмент может происходить за счет слияния сестринских хроматид парного фрагмента и развертывания их по длине.
   
2. Парные фрагменты - это фрагменты изохроматидного или хромосомного происхождения. О соединении поврежденных концов сестринских хроматид, а не об отставшей хромосоме можно говорить только при условии, если парный фрагмент имеет дугообразный вид. Следует отметить, что оценка этого признака крайне затруднительна и поэтому не может проводиться во всех случаях.
   
3. Мосты иногда разделяют на хромосомные и хроматидные. Под хромосомным мостом понимают дицентрическую хромосому: он состоит из двух хроматид, чаще всего перекрещенных. Хроматидный мост - дицентрическая хроматида, поэтому он виден как одиночный. По "толщине" моста нельзя судить о его хромосомном или хроматидном характере. К сожалению, не всегда можно  дифференцировать характер моста и поэтому вряд ли целесообразно проводить такое разделение при использовании тотального метода окрашивания хромосом, не позволяющего идентифицировать отдельные хроматиды.
   
4. Отставшие хромосомы или хроматиды чаще всего распознаются легко, так как в них можно видеть центромеру либо неоднородность структуры, что нехарактерно для фрагментов. Наибольшие трудности возникают при необходимости отличить отставшую метацентрическую хроматиду от акроцентрической хромосомы. Вместе с тем ответ на этот вопрос важен, потому что в результате отставания хромосомы образуются две гиплоидные клетки, а в результате отставания хроматиды одна гипоплоидная и одна нормальная клетка.
   Абсолютного стандарта для учета аберраций и для представления полученных результатов быть не может. На практике встречаются сочетания разных типов аберраций в одной и той же клетке. Теоретически можно ожидать любые сочетания аберраций. Основой этого является асинхронность редупликации наследственного материала. Кроме того попутно другие, реже встречающиеся типы аберраций, такие как мультиполярные митозы и полиплоидии, так же могут регистрироваться.

Рекомендации по проведению ана-телофанзного анализа

Для большинства исследований можно рекомендовать следующее:

1. Важным условием при оценке типов (спектра и частоты хромосомных аберраций) является проведение их учета в первом после действия мутагена клеточном делении. Это связано с тем, что значительная часть аберраций а аберрантных клеток элиминируется уже после первого деления или приобретает другой вид, хотя некоторые хромосомные аберрации, которые наблюдаются в виде мостов, могут сохраняться в течении 12-15 митотических циклов.
   
2. Не проводить анализ перестроек при наложении клеток и при нарушении целостности их оболочки
   
3. Принимать во внимание все типы морфологических изменений , учет которых возможен при данной методике
   
4. Анализировать изменения поклеточно, т.е. регистрировать в протоколе опытов сочетаемость аберраций, встречающихся в каждой клетке.
   
5. Клетки в которых не удается определить тип аберраций, нужно относить к классу клеток с неразобранными аберрациями; их подсчитывать только в подсчете общего количества аберрантных клеток
   
6. Быть крайне осторожным при объединениях любого рода (например, данных по отдельным повторностям и данных аналогичных опытов, по точечным фрагментам и кольцам, по дицентрикам и сопутствующим ацентрикам и т.д.). Если правомочность какого-то объединения доказана для некоторого объекта или или условий, то для других объектов и условий она должна специально проверяться
   
7. При представлении данных в статье необходимо указывать число обследованных особей (или повторностей опыта), число проанализированных клеток, число каждого из учитываемых типов аберраций, типы аберрантных клеток и их частоту, число анеуплоидных клеток.
   Для точного определения необходимо знать структуру кариотипа изучаемого вида растений или животных в норме.

Статистическая обработка

Для статистической обработки числовых массивов, полученных в результате подсчета клеток, применяются различные стандартные методы статистики, такие как хи-квадрат-тест, t-критерий Стьюдента и дисперсионный анализ. Для фазы статистической обработки данных ана-телофазного анализа могут использоваться программы универсального назначения, такие как Statistica или Excel. Но так же могут применяться специфицированные программы, расчетная тематика которых предназначена именно для анна-телофазного анализа. Обычно это адаптированные варианты Excel, такие как (Allium test - Matrix) созданная Романовским А.В. и коллегами.

(Автор: Песня Д.С.)

Литература:

1. Прохорова И.М., Ковалева М.И., Фомичева А.Н. Оценка митотоксического и мутагенного действия факторов окружающей среды: Метод. указания / И.М. Прохорова и соавт. - ЯрГУ. Ярославль, 2003. – 32.
   
2. Калаев В.Н., Карпова С.С., Цитогенетический мониторинг: методы оценки загрязнения окружающей среды и состояния генетического аппарата организма / В.Н. Калаев и соавт. – Воронеж, 2004. - 80 стр.
   
3. Jette Rank The method of Allium anaphase–telophase chromosome aberration assay / Ekologija (Vilnius), Nr. 1, 2003. – p. 38-42(перевод с английского Песня Д.С.)